تولید گندم تراژن مقاوم به ویروس کوتولگی زرد جو ‭(BYDV-PAV) ‬با استفاده از روش خاموشی ژن

کوتولگی های زرد جو و غلات از مهم ترین بیماری های ویروسی اند که زراعت غلات دانه ریز را تهدید می نمایند. این بیماری ها در سطح دنیا پراکنده بوده و خسارت های قابل توجهی را در جو، یولاف، گندم، ذرت و برنج بر جا می گذارند. روش های متعددی از جمله تغییر در شرایط زراعی و نیز استفاده از منابع مقاومت به منظور کاهش میزان خسارت آنها معرفی شده اند. محدودیت تعداد ژن های مقاومت و تحمل در گندم و جو استفاده از روش های نوین بر پایه مقاومت های با منشا بیمارگر ‭(pathogen derived resistance‬، ‭PDR) ‬به ویژه خاموشی ژن بواسطه آر ا ن ا ی را توجیه می نماید. در این تحقیق رهیافت خاموشی ژن به عنوان روشی کارا به منظور ایجاد مقاومت در برابر عوامل ویروسی به کار گرفته شد. به این منظور تراریخت سازی گندم با استفاده از اگروباکتریوم با بکارگیری ناقل ‮‭3301‬ ‭pCambia ‬که دارای ترادف ژن گزارشگر ‭GUS ‬می باشد، بهینه سازی گردید. تراریختی گندم و انتقال ژن گزارشگر ‭GUS ‬بر اساس باززایی مستقیم و غیر مستقیم جنین رسیده گندم نان بهینه سازی شد. انجام تراریختی با استفاده از‭Agrobacterium tumefaciens ‬استرین ‭AGLO ‬صورت پذیرفت. غربالگری گیاهان تراژن دارای ریشه که از مرحله انتخابی (علف کش مناسب) گذر کرده بودند، با استفاده از آزمون های زنجیره ای پلیمراز و نیز سنجش بافت شیمیایی بیان ژن ‭GUS ‬تایید شد. پس از انجام بهینه سازی های مختلف، تراریخت سازی گندم به منظور بکارگیری روش خاموشی ژن بر علیه ویروس کوتولگی زرد جو ‭(BYDV-PAV) ‬صورت پذیرفت. بدین منظور سازه ی خاموشی ژن سنجاق سری دارای اینترون با استفاده از ترادفی از ژن پلیمراز این ویروس طراحی گردید. سازه ی خاموشی ژن سنجاق سری دارای اینترون، در طی واکنش های هضم آنزیمی و الحاق با موفقیت ساخته شد. صحت ترادف و جهت سازه ها با استفاده از آزمون های زنجیره ای پلیمراز، هضم آنزیمی و ترادف یابی به تایید رسید. تراریخت سازی با استفاده از اگروباکتریوم و جنین رسیده در محیطهای بهینه سازی شده انجام پذیرفت. ریزنمونه ها به صورت مستقیم باززایی و پس از عبور از محیط حاوی ماده انتخاب کننده و تشکیل ریشه مناسب به خاک منتقل شدند. تایید تراریختی بوته ها با آزمون های زنجیره ای پلیمراز و هیبریداسیون با استفاده از شناسگر غیر رادیواکتیو انجام پذیرفت. همچنین آزمون سنجش زیستی به منظور ارزیابی میزان مقاومت بوته های تراریخت در برابر ویروس با مایه زنی با استفاده از شته ‭Rhopalosiphum padi ‬حامل ‭BYDV-PAV ‬انجام شد. عملیات تراریختی منجر به تولید تعدادی گیاه شد که پس از عبور از مرحله غربالگری با موفقیت به خاک منتقل شدند. آزمون های زنجیره ای پلیمراز و نیز هیبریداسیون غیر رادیواکتیو تراریختی تعدادی از این بوته ها را نشان دادند. تعدادی از بوته های تراریخت گندم الوند که با ویروس مایه زنی شده بودند، علایم بیماری شامل زردی و کوتولگی را بروز نداده، بر اساس آزمون الیزا از عیار ویروس پایینی برخوردار بودند. این در حالی بود که زردی و قرمزی به همراه کوتولگی در بوته های الوند غیرتراریخت و سایر گیاهان کنترل مثبت قابل مشاهده بود. ارزیابی های تکمیلی در خصوص میزان تفرق و محاسبه نسبت های توارث پذیری در لاین های T2 و نسل های بعدی انجام خواهد شد. واژه های کلیدی: گندم، تراریختی، خاموشی ژن، ویروس کوتولگی زرد جو